RT-PCR完整攻略-原理介绍、引物设计、数据处理、绘图

• 阅读： 2024/2/1 15:11:52

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  原理介绍

  定量逆转录PCR（quantitative reverse transcription PCR, RT-qPCR）是应用于以RNA作为起始材料的PCR实验中的一种实验方法。在该方法中，总RNA或信使RNA（mRNA）首先通过逆转录酶转录成互补DNA（cDNA）。随后，以cDNA为模板进行qPCR反应。RT-qPCR已被用于多种分子生物学的应用中，其中包括基因表达分析、RNA干扰验证、微阵列验证、病原体检测、基因测试和疾病研究。

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  RT-qPCR的一步法与两步法

  RT-qPCR可通过一步法或两步法来完成（图1、表1）。一步法RT-qPCR把逆转录与PCR扩增结合在一起，使逆转录酶与DNA聚合酶在同一管内同样缓冲液条件下完成反应。一步法RT-qPCR只需要利用序列特异性引物。在两步法RT-qPCR中，逆转录和PCR扩增过程是在两个管中完成，使用不同的优化的缓冲液、反应条件、以及引物设计策略。

  图 1.一步法与两步法RT-qPCR

  优点 缺点

  一步法

  由于两步反应都在一个管中完成，因此该方法具有更少的实验误差

  更少的移液步骤能够减少污染的风险

  适用于高通量扩增/筛选，快速且可重现性高

  无法分别对两步反应进行优化

  由于反应条件是结合两步反应折衷得到的，因此灵敏性不如两步法

  单一样品检测的靶点数较少

  两步法

  能够建立可以长期保存，并用于多次反应的稳定的cDNA库

  靶基因和内参基因能够从同一个cDNA库进行扩增，而不需要多重cDNA库

  能够优化单一反应过程的反应缓冲液和反应条件

  灵活的引发条件选择

  使用多个试管，以及更多的移液步骤会增加DNA污染的风险,

  并且耗时。

  相较于一步法，需要进行更多的优化

  表 1.一步法及两步法RT-qPCR优缺点比较

  Real-time PCR（实时荧光定量PCR）也可以缩写为RT—PCR，此外还有一个qPCR（Quantitative Rea-ltime-PCR ），有人可能将这三者搞混。

  其实Rea-ltime-PCR和 qPCR（Quantitative Rea-ltime-PCR ）都是指实时定量PCR，即在PCR进行的同时，对其过程进行实时监测，可以对起始模板数量进行精确的分析。并且国际上的约定俗成的是：RT-PCR特指反转录PCR，而Real-time PCR一般缩写为 qPCR（quantitative real-time PCR）。

  RT-PCR的方法已经广泛应用于RNA的构造解析、cDNA的克隆及RNA水平上的表达解析等多种领域。

  RT-PCR是分子生物学中一项常规的实验，但对于刚刚进入实验室的小伙伴来说可能比较陌生。今天，我们就来聊聊如何进行RT-PCR操作。

  准备阶段：合成引物，购买RNA提取试剂盒，购买反转录试剂盒，购买RT-PCR试剂盒，购买耗材：八联管，无酶加样枪头，无酶手套。

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  引物设计

  在进行RT-PCR之前，我们需要设计拟分析基因的引物，如何设计呢？首先我们需要找到该基因的编码序列CDS(Coding sequence)。这里我们以血红素加氧酶HO-1基因为例，在PubMed中的Gene数据库中进行查找。

  点击Search, 进入下级界面，找到正确种属，这里以human为例

  点击HMOX1，进入下级界面，往下翻

  点击红色方框内链接，进入下级界面，往下翻，找到CDS

  点击CDS,进入下级界面

  点击右下角的FASTA,就能得到我们需要的序列

  方框中的序列即为HO-1的编码序列。有了编码序列接下来可以设计引物了，网上很多网站可以进行这一工作，这里我们偷下懒，用上海生工的免费引物设计功能

  当引物设计好后，就可以开始正式实验了。注意除了目的基因的引物，还需要内参基因引物，例如β-Actin,GAPDH。

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  RNA提取、检测

  提取RNA：提取RNA,常用的如trizol法，吸附柱法。当然，这些都有相应的试剂盒，这里不做推荐。根据经费情况选择适宜的国产或进口试剂盒，按照说明进行操作就可以了。

  RNA纯度检测:当用试剂盒提取到RNA后，需要对RNA的纯度进行检测，一般用微量分光光度计测定OD260/OD280的比值，介于1.9-2.0（或1.8-2.0）说明RNA纯度较高。

  RNA完整性检测：通过RNA电泳，检测28S,18S,5S等小分子RNA条带，具体操作步骤根据购买的试剂盒说明书进行。

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  逆转录

  逆转录：这一步的目的是将RNA逆转录成cDNA,购买相应的反转录试剂盒，按照说明书进行操作即可。注意，该操作在八联管中进行，会用到qpcr仪（根据实验室qpcr仪操作说明完成操作）

  qPCR:得到cDNA后，可以对其进行扩增并检测，SYBR染料法和探针法比较常用，根据需求选择相应的试剂盒。将相关试剂加入八联管(一般来说每个样本设置3个或4个复孔。记得要加入内参基因!)，放入qpcr仪中,设置好温控程序，该程序可以使用qpcr试剂盒说明书推荐的程序，也可以按照实验室以往设置好的程序。

  等待一两个小时后，就可以导出我们所需的Ct值进行分析了。但现在很多qpcr的程序中只能导出Cq值，两者是可以互通的。

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  数据分析

  数据分析：假设我们得到下面一组数据（瞎编的数据,Well编号出现了重复，之前没有注意，大家无需理会）

  对数据进行分析：我们可以获得基因的绝对表达情况，需要作标准曲线，这也不难。但用得更多的是评估每个基因的相对表达。一般采用2-ΔΔCt计算，这里简单演示一下。

  利用公式计算复孔平均值

  ΔCq=每组内基因的Cq-内参基因的Cq

  如法炮制，得到所有的ΔCq

  ΔΔCq=实验组基因的ΔCq-对照组Control对应基因的ΔCq，如图所示

  有了ΔΔCq，接下来就可以计算2-ΔΔCt

  选择公式，输入power,点击转到

  进入power函数设置窗口

  Number输入底数，Power输入幂值-ΔΔCq

  重复三次试验，就可以获得三次数据，有了三次数据，就可以进行统计分析了（有的数据处理是进行三次独立实验，有的会有其他操作，这里仅对方法介绍）。

  统计分析：打开graphpad

  输入三次实验的数据，这里没有实验数据，就随便填写了几个

  输入数据后，点击Analyze,对实验数据进行统计学分析，选择适合自己实验的统计学方法

  另外，点击Graphs可以绘制

  至此，RT-PCR实验流程基本走完。

  转自：“Super Lab”微信公众号

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